BRE团队新进展：基于细胞团簇颗粒凝胶生物墨水的复杂组织3D打印
生物3D打印在复杂组织构建方面具有优势，但其难以精确复现出天然组织的复杂微结构、细胞类型组分和生理细胞密度，限制了体外组织器官的功能重建。通过融合工程化手段和发育生物学来体外重现组织发育的过程，是再生医学领域的发展趋势。基于此，清华大学机械工程系生物制造中心熊卓、张婷课题组（BRE团队）提出了一种基于细胞团簇紧密堆积的颗粒凝胶生物墨水，其具有细胞凝聚状态、自组装和血管生成能力，生物3D打印构建了具有高细胞密度和丰富血管的功能性肝组织和骨组织，为大尺度活性组织器官的制造提供了新思路。相关工作成果近期分别发表于《Biofabrication》和《ACS Applied Materials & Interfaces》。
这两篇文章第一作者为清华大学机械系生物制造中心方永聪助理研究员，通讯作者为清华大学机械系生物制造中心副主任熊卓教授。清华大学机械系生物制造中心主任孙伟教授、张婷副教授及22级博士生吴炳炎、22级硕士生杨艺、21级本科生孙若斌、21级本科生王格等共同参与了本研究工作。该研究获得了国家自然科学基金联合基金重点资助项目（U21A20394）等项目支持。
一、细胞团簇颗粒凝胶生物墨水
BRE团队提出的新型细胞团簇颗粒凝胶生物墨水主要由高含量细胞团簇（如细胞球体、类器官）与细胞外基质水凝胶材料共混形成。由于细胞团簇处于塞积状态，使得颗粒凝胶生物墨水自动获得独特的剪切变稀、屈服应力和快速可逆愈合特性，从而具有优异的3D打印特性。采用通用的非粘附PDMS微孔板可以快速（<48小时）、高通量制备高活性（>95%）的组织细胞或干细胞（如HepG2、MSC细胞）团簇，通过改变细胞接种密度可以调整细胞团簇的尺寸。进一步，通过添加内皮细胞并优化组织细胞与内皮细胞之间的比例（最优比例为2:1），可以制备高度血管化的细胞团簇。
考虑到细胞团簇在挤出过程中剪切损失，本研究通过调整针头-团簇尺寸比例（≮3.5），优化团簇含量和打印温度等成形参数，使得打印后细胞活性在80%以上，且细胞密度高达~1.5×108/mL，接近人体实体组织（如心脏、肝脏）的生理细胞密度，是常规生物挤出打印难以实现的（细胞密度在106/mL~107/mL）。通过直接或悬浮打印构建网格、耳朵、鼻子等复杂结构，荧光和扫描电镜图像显示打印初期细胞团簇处于紧密堆积状态，形成类石榴结构，培养数天后观察到细胞迁移、血管新生和球体融合等现象，类似于体内组织重塑和形态发生。另外，打印结构表现出类天然组织的超弹性特点。
二、Biofabrication：3D打印血管化异质致密肝组织
在肝细胞团簇颗粒凝胶生物墨水的连续相凝胶中引入内皮细胞，可以在1天内快速形成丰富的毛细血管，并可稳定保持一周以上，可通过VE-Cadherin特异性染色和血管数量定量分析证实。QT-PCR和ELISA实验结果证明基于颗粒凝胶生物墨水打印构建的肝组织结构的，相比于常规生物墨水，其白蛋白和尿素分泌水平显著提升，同时多种肝标志物表达水平上调，说明细胞凝聚状态和血管化共同促进了肝组织的代谢功能。
进一步，通过采用载内皮细胞的牺牲墨水打印构建数百微米尺寸的可灌注血管通道，有助于大尺寸致密肝组织的长期活性维持。具体地，打印后1天内可观察到明胶墨水的溶出和内皮细胞的贴壁，培养到第7天，随着内皮细胞的增殖和融合，可以观察到内皮化的血管通道并侵入到周围肝细胞团簇，形成跨尺度血管。本研究初步证明了结合细胞团簇颗粒凝胶生物墨水和牺牲打印策略，可以形成具有跨尺度血管网络的致密肝组织结构。
三、ACS Applied Materials & Interfaces：3D打印血管化骨组织
采用预血管化的间充质干细胞团簇作为基本构建单元，以GelMA和纤维蛋白原复合（Gelbrin）凝胶作为凝胶组分，形成一种细胞团簇颗粒凝胶生物墨水。首先，本研究对比了四组含有hMSCs/HUVECs的生物墨水，以评估该生物墨水的血管化能力。荧光标记观察到基质凝胶中内皮细胞在干细胞团簇诱导下能够在第1天迅速自组装形成毛细血管网络，同时预血管化团簇能够在短时间内迁移到周围基质凝胶形成一个相互贯通的微血管网络。血管数量的定量分析和基因表达水平均表明这种基于预血管化细胞团簇的生物墨水具有更强的血管形成能力。
进一步，我们在第3天切换到成骨分化培养基以评估其成骨分化潜能。在成骨分化条件下，颗粒凝胶生物墨水形成的微血管网络能够长期维持，而常规生物墨水中形成的微血管则迅速退化。在成骨分化第3~4周，实验组观察到Runx2和OPN的更高表达，同时H&E、茜素红染色和Masson三色染色表明实验组中钙沉积和胶原蛋白形成。由于成骨和血管化过程高度耦合，相比于对照组，实验组的BMP-2、VEGF、ALP、Runx2和SOST等血管化和成骨基因表达水平均上调。本研究初步证明了颗粒凝胶生物墨水在血管化骨组织构建方面的优势，未来将进一步通过动物实验验证其在骨缺损修复方面的应用。
BRE团队提出一种基于细胞团簇紧密堆积的颗粒凝胶生物墨水，其具有细胞凝聚状态、自组装和血管生成能力，在具有高细胞密度、丰富血管网络的功能性组织（如肝组织和骨组织）构建方面具有显著优势，为组织工程与再生医学提供新的使能技术。未来将结合干细胞衍生的类器官和类装配体，3D打印构建个性化复杂组织器官，拓展其在复杂组织器官构建和生理病理研究方面的应用。